Первым серийным вариантом Flying Fortress стал B-17B (Model 299M). Первоначально самолету было дано обозначение Boeing Model 299E, но изменения в спецификациях Air Corps рассматривались достаточными для введения нового заводского обозначения Model 299M.
Внешне B-17B отличался от Y1B-17 применением руля направления с большей площадью и несколько измененной формой, большими закрылками и измененной носовой частью. Носовая турельная установка пулемета была переведена в верхнюю переднюю часть плексигласового носового обтекателя, в нижней части которого имелась стеклянная плоская панель для бомбоприцела. Первоначальный вариант расположения носового пулемета, использовавшийся на Y1B-17, оказался непригодным для применения в боевых условиях. Новая носовая установка представляла собой простое гнездо для переносного 7,62 мм пулемета. Посетивший в 1938 году США British Air Commodore Артур Харрис (Arthur Harris), ставший в годы войны командующим Bomber Command RAF, после осмотра Y1B-17 заявил, что расположение носового пулемета ":больше соответствовало аттракциону, чем боевому самолету:". Харрис вообще критически отнесся к защитному вооружению Y1B-17, которое соответствовало требованиям 1935 года и к 1938 году стало недостаточным.
Измененная носовая часть позволила уменьшить полную длину Flying Fortress на 7 дюймов. На крыше кабины пилотов немного позади кресел пилотов появился небольшой сферический плексигласовый купол. В качестве силовой установки самолет получил более мощные двигатели R-1820-51, которые развивали взлетную мощность 1200 л.с. и 900 л.с. на высоте 25000 футов. Помимо этого на самолете был представлен ряд изменений внутренних систем. Были перемещены члены экипажа: место штурмана переместили из-за пилотов в носовую часть, где он имел лучший обзор.
Помимо перечисленных крупных изменений в конструкцию Flying Fortress был внесен и ряд мелких. Так закрылки вместо полотнянной обшивки получили алюминиевую, а пневматический привод тормозов шасси сменили на гидравлический.
Над окном в носовой части был установлен ставший впоследствии широко известным бомбоприцел Norden. Гиростабилизированный бомбоприцел Norden был предложен Карлом Норденом (Carl L. Norden) и капитаном Фредериком Энтвистлем (Frederick I. Entwistle). Новый бомбоприцел отслеживал отклонения курса самолета от расчетного и выдавал поправку. В более поздних версиях бомбоприцел Norden был объединен со специальным автопилотом, управляющим самолетом во время подхода к цели. Задача бомбардира заключалась в нацеливании оптического визира на гироскопической платформе на нужный объект и передаче дальнейших действий автомату. Тот отслеживал отклонения курса от расчетного, корректировал их с помощью рулей самолета и в нужный момент осуществлял сброс бомб. Затем управление вновь переходило в руки пилота. В те годы в официальных сообщениях для прессы бомбоприцел рекламировался настолько точным, что с его помощью можно было ":попасть бомбой в бочку с рассолом". Несмотря на такие сообщения в прессе, бомбоприцел Norden был строго засекречен: прицел устанавливали на самолет непосредственно перед вылетом и закрывали чехлом, а после приземления - сразу снимали. Процесс установки-снятия бомбоприцела всегда проводился под наблюдением вооруженной охраны.
Первый B-17B (╧ 38-211) совершил первый полет в Сиэтле 27 июня 1939 года. Всего завод Boeing в Сиэтле изготовил 39 B-17B. Однако из-за сложностей с получением финансирования Air Corps, серийные номера USAAC были разбиты на несколько серий: 38-211/223, 38-258/270, 38-583/584, 38-610 и 39-1/39-10.
Все 39 B-17B были поставлен USAAC за промежуток времени между 29 июля 1939 года и 30 марта 1940 года. Все B-17B поступили на вооружение 2-й, 7-й и 19-й BG (Bombardment Group - бомбардировочная группа), кроме одного самолета, оставленного на Wright Field для испытаний.
В ноябре 1939 года семь Flying Fortress совершили полет доброй воли от Langley Field до Рио-де-Жанейро, Бразилия. Все самолеты благополучно возвратились без больших неисправностей, еще раз продемонстрировав безопасность и надежность проекта B-17.
В 1940-41 годах многие B-17B прошли модернизацию с целью внедрения ряда изменений, в том числе установлены не выступающие за пределы фюзеляжа установки 12,7 мм пулеметов по типу B-17C
27 октября 1941 года B-17B из 41-й разведывательной эскадрильи 2-й BG, базировавшейся на Ньюфаундленде, атаковал немецкую подводную лодку. Хотя лодка не получила повреждений, эта атака стала первой, осуществленной в ходе второй мировой войны самолетом армейских ВВС против немецких вооруженных сил. Поскольку на тот момент США официально не участвовали в войне против Германии, этот инцидент не получил широкой огласки.
Оставшиеся к октябрю 1942 года B-17B получили новое обозначение RB-17B (где литера R указывала на ограниченные возможности эксплуатации машины). Переобозначенные самолеты использовались для не боевых учебных полетов, транспортировки грузов, а также в качестве связных и курьерских.
